CBC●PBS●ESR●Retic●Electrophoresis Ham test● OF test●

رنگ‌امیزی PBS

متداولترین رنگ مورد استفاده رایت گیمسا است

رایت معمولا به تنهایی استفاده نمیشود

گیمسا به تنهایی برای شناسایی تک یاخته های خونی استفاده می شود

 نکته های مهم در رنگ آمیزی

• اسلایدهایی که بیش از یک هفته مانده اند، آبی رنگ می گیرند. • قرار گرفتن اسلاید در برابر تابش نور خورشید موجب پژمردگی رنگ می شود.

• رنگ آمیزی گلبولهای قرمز به رنگ آبی تا ،سبز، نشانه طولانی بودن زمان رنگ آمیزی یا قلیایی بودن بافر است.

کنند.‌برای نگهداری گستره محیطی رنگ ،نشده بایستی آن را با متانول فیکس نمود. در غیر این صورت پروتئینهای خشک شده در اسلاید کهنه زمینه آبی رنگ ایجاد کرده و بررسی گستره را دشوار می • برای پاک کردن رسوب رنگ از روی ،گستره می توان برای چند ثانیه آن را در متانول قرار داد و سپس آبکشی .کرد چنانچه رسوب مانع از ارزیابی گستره شود باید گستره جدید تهیه کرد یا با متانول رنگ آن را کاملاً پاک و دوباره رنگ آمیزی کرد.

• برای جلوگیری از رخ دادن آرتیفکت ،آب باید از رنگ آمیزی در هوای مرطوب و نمناک آزمایشگاه خودداری کرد آلوده شدن الکل فیکساتیو یا رنگ با آب موجب ظاهر شدن واکوئل در گلبول های قرمز می شود و چنانچه واکوئلها در هاله مرکزی قرار بگیرند موجب گزارش کاذب هیپوکروم می.شوند این مورفولوژی کاذب را که ناشی از آرتیفکت آب است Torocyte می نامند.

• رنگ آمیزی در هوای مرطوب ممکن است همراه با ایجاد گلبول های قرمزی باشد که کنارههای آنها خورده شده شبیه خوردگی موریانه

و یا مورفولوژی اکینوسیت داشته باشند.

عوامل مداخله گر و مشکلات ایجاد شده در رنگ آمیزی

آبی شدن بیش از اندازه گسترشهای ،ضخیم افزایش زمان رنگ ،آمیزی شستشوی ناکافی قلیایی بودن زیاد رنگ یا محلول رقیق ،کننده باعث ایجاد بازوفیلی بیش از اندازه میشود.

در این حالت گلبولهای قرمز به رنگ آبی یا سبز در می آیند، کروماتین هسته رنگ آبی تیره یا سیاه می گیرد و گرانول های نوتروفیلها به شدت رنگ میگیرند و بزرگ و برجسته بنظر می رسند و ممکن است با گرانولهای توکسیک اشتباه شوند.

کم کردن زمان رنگ آمیزی یا استفاده از رنگ کمتر و رقیق کننده بیشتر ممکن است این مشکل را برطرف کند در صورتی که این روش  ها بی تأثیر باشند، احتمال دارد که بافر بیش از اندازه قلیایی باشد و باید بافری با pH کمتر تهیه کرد.

صورتی شدن بیش از اندازه

رنگ آمیزی ،ناقص طولانی بودن زمان ،شستشو، چسباندن لامل ها پیش از خشک شدن آنها یا زیاد بودن قدرت اسیدی رنگ یا بافر

ممکن است منجر به اسیدوفیلی بیش از اندازه شود.

در اینگونه گستره،ها گلبولهای قرمز رنگ قرمز درخشان یا نارنجی به خود میگیرند کروماتین هسته آبی کم رنگ می شود و گرانول های ائوزینوفیل به رنگ قرمز درخشان در می آیند.

رنگ آمیزی در مجاورت بخار اسید و آلوده شدن وسایل رنگ آمیزی به اسید، علت این امر میباشد در ضمن متانول در اثر ماندن به اسید فورمیک تبدیل میشود و میتواند در صورتی شدن گستره خون‌محیطی دخیل باشد.

ایجاد زمینه آبی رنگ

پروتئینهای فاز حاد در بیماریهای التهابی و پاراپروتئین ها پروتئینهای ،منوکلونال به علت تمایل به رنگ های متیلن بلوآزور ایجاد زمینه آبی رنگ می.کنند این مسئله در موارد زیر دیده می شود: . کم خونی بیماریهای مزمن به علت افزایش پروتئین های فاز حاد سیروز کبدی ناشی از افزایش گاماگلوبولین

بیماریهای اتوایمیون ناشی از افزایش پلی کلونال گاماگلوبولین

مالتیپل میلوما ناشی از تولید زیاد ایمونوگلوبولین ها

حضور کرایوگلوبولین ناشی از بیماریهای التهابی یا هپاتیت یا

اختلالات پلاسماسل

ضد انعقادهای هپارین

Esr

شرایط و ملاحظات نمونه گیری

• نوع نمونه قابل اندازه گیری خون کامل حاوی ضد انعقاد سیترات سدیم یا EDTA

. حجم نمونه مورد نیاز ۲ میلی لیتر نمونه حاوی ۱.۶ میلی لیتر خون کامل به همراه ۰.۴ میلی لیتر ضد انعقاد سیترات سدیم ) نسبت ۴ به 1

• نیاز به ناشتایی یا آمادگی خاصی ندارد

• در صورت امکان داروهای مؤثر بر نتایج آزمایش را قطع نمایید. • بالافاصله خون گرفته شده را به آرامی با سر و ته کردن لوله محتوی

نمونه مخلوط کنید حداقل ۴ مرتبه

• از سانتریفیوژ کردن نمونه خوداری نمایید.

• پلاسما باید شفاف و عاری از همولیز لیپمیک و فیبرین باشد. • مصرف هرگونه داروی مؤثر بر نتایج آزمایش را روی برگه بیمار ثبت

نمایید.

• در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه نمونه را بالافاصله به

آزمایشگاه منتقل کنید.

 مراحل اجرایی کار روش) و سترگرن اصلاح شده

-۱ نمونه خونی را که برای آزمایش CBC گرفته شده حاوی EDTA) به نسبت ۱ حجم سیترات سدیم ۳.۸ یا کلرید سدیم ۰.۸۵) و ۴ حجم خون مخلوط کرده و به خوبی با سروته کردن آن را یکنواخت

کنید.

-۲- سپس پیپت وسترن گرن را تا علامت صفر از نمونه خون پر کرده و دقیقاً به طور عمودی در پایه پیپت سدیمان در حرارت اتاق و محلی

بدون ارتعاش و تماس مستقیم نور قرار دهید

-۳- بعد از گذشت ۶۰ دقیقه، فاصله بین علامت صفر تا رأس ستون گلبولهای قرمز را برحسب میلی متر به عنوان مقدار ESR گزارش کنید در صورتی که کدورتی در محدوده بین پلاسما و ستون گلبول های قرمز وجود داشته باشد اولین جایی از ستون که تراکم کامل

داشته باشد سطح ESR محسوب می شود.

 corrected ESR = measured ESR × 15 / [55- Hct]) 

for  samples with Hct<35%

شمارش رتیکولوسیت

Relative Reticulocyte Count=(Retic/RBC)×100

Absolute Reticulocyte Count=Retic%×RBC count

Corrected Reticulocyte  Count(Reticolocyte  Index)=Retic%×HCT patient/HCT normal

Production Reticulocyte Count(Reticolocyte Production Index)=Retic%/maturation ×HCT patient/HCT normal

maturation time

1  for Hct  36-45

1.5 for Hct  26-35

2 for Hct  16-25

2.5 for Hct<16

Retic percentage normal range

0.5-2%  for non anemic adult

2-6% for  non anemic newborn

Retic count normal range

50000-75000

RPI normal range

<2 indicates hypopriferative anemia

>2 indicates hyperproliferative anemia

روش انجام شمارش دستی

خون کامل EDTA دار با یکی از رنگهای حیاتی مانند نیومتیلن بلو

یا بریلیانت کرزیل بلو مجاور میشود.

برای تهیه این رنگها یک گرم از آنها را در ۱۰۰ میلیل یتر بافر فسفاته (PBS) با ۷.۴ pH حل کرده و در ظروف تیره و در دمای یخچال نگهداری کنید

رنگ ساخته شده در دمای یخچال به مدت یک ماه قابل نگهداری است. دقت شود که قبل از استفاده از ،رنگ آن را بوسیله کاغذ واتمن

شماره یک فیلتر کنید

•

١- حجمهای مساوی از خون را با یکی از رنگهای حیاتی مخلوط

کرده و به مدت ۲۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.

رنگهای حیاتی با عبور از غشاء گلبولهای قرمز در حالت زنده روی ریبوزومها و رشتههای RNA موجود در رتیکولوسیت ها رسوب کرده و آن ها را به رنگ آبی سیر بصورت رسوبی از گرانول یا فیلامنت، قابل مشاهده می سازد.

۲- دو لام تهیه کرده و پس از خشک شدن با استفاده از عدسی ،روغنی به شمارش رتیکولوسیتها در مناطقی که پخش یکنواختی از سلولها وجود دارد می پردازیم

گلبولهای قرمز آبی کم رنگ یا آبی متمایل به سبز و رتیکولوسیتها آبی کم رنگ به همراه موارد رشته ای یا گرانوالار به رنگ آبی تیره دیده می شوند. حداقل ۱۰۰۰ گلبول گلبول قرمز و رتیکولوسیت شمارش می شود و سپس درصد رتیکولوسیتها را محاسبه میکنیم برای مثال اگر ۱۵ رتیکولوسیت در بین ۱۰۰۰ گلبول شمارش شوند، شمارش رتیکولوسیت ۱/۵ درصد خواهد بود.

 با قرار دادن دیسک میلر در قسمت عدسی ،چشمی دو مربع در میدان

دید ظاهر میشوند که یک مربع نه برابر مربع دیگر بوده و از این طریق برآورد سریعی از تعداد گلبولهای قرمز امکان پذیر می شود. در میدان های میکروسکوپی پشت سر ،هم رتیکولوسیتها را در مربع بزرگ و گلبولهای قرمز را در مربع کوچک شمارش می کنند